Хроматография: как разделяют смеси веществ

Чернила фломастера кажутся веществом одного цвета, пока капля воды не поднимется по полоске бумаги. Тогда на листе появляются несколько цветных зон: синий, фиолетовый, жёлтый или зелёный компоненты расходятся на разные расстояния. Такой опыт показывает идею хроматографии. Это способ разделить смесь на составляющие и, если есть образцы для сравнения, предположить, какие вещества в ней присутствуют.

Хроматография нужна не потому, что все компоненты смеси обязательно имеют разный цвет. Большинство веществ бесцветны, но они по-разному взаимодействуют с поверхностью сорбента и растворителем. Поэтому частицы движутся с разной скоростью. Одни почти не задерживаются и уходят далеко вместе с растворителем, другие сильнее удерживаются на поверхности и остаются ближе к старту. Полученные отдельные пятна или полосы называют хроматограммой.

Что такое хроматография

Метод впервые использовал русский ботаник Михаил Цвет в начале XX века. Он пропускал раствор растительных пигментов через колонку с адсорбентом и увидел отдельные окрашенные слои. Так удалось разделить хлорофиллы и каротиноиды, которые в зелёном листе вместе дают привычную окраску. Современные приборы стали намного точнее, но основной принцип остался прежним: компоненты смеси проходят через систему не одновременно.

Хроматографию не следует путать с фильтрованием. При фильтровании твёрдые нерастворимые частицы задерживаются фильтром, а раствор проходит через него почти без разделения растворённых веществ. В хроматографии вещества находятся в растворе или газе и многократно переходят между двумя средами. Из-за разной силы притяжения к этим средам они расходятся по положению на пластинке, бумаге или по времени выхода из прибора.

Неподвижная и подвижная фазы

В любом хроматографическом опыте есть две фазы. Неподвижная фаза остаётся на месте и удерживает компоненты смеси. В бумажном варианте её роль играет целлюлоза бумаги вместе со связанной водой. В тонкослойной хроматографии это тонкий слой силикагеля, оксида алюминия или другого сорбента на пластинке. Поверхность таких материалов способна притягивать молекулы.

Подвижная фаза перемещается через неподвижную и переносит с собой вещества. Ею служит растворитель или смесь растворителей, а в некоторых приборах газ. Под действием капиллярных сил жидкость поднимается по бумаге или пластинке. По пути молекулы то растворяются в подвижной фазе и движутся дальше, то удерживаются неподвижной фазой. Чем дольше компонент задерживается на сорбенте, тем медленнее он перемещается.

На результат влияют строение вещества и свойства растворителя. Полярные молекулы обычно сильнее притягиваются к полярному силикагелю, поэтому при одинаковом растворителе проходят меньший путь. Неполярные вещества удерживаются слабее и часто движутся дальше. Это правило не заменяет опыт: растворитель, кислотность, температура и примеси способны заметно изменить картину. Для хорошего разделения подбирают такую подвижную фазу, при которой пятна не остаются на старте и не достигают фронта вместе.

Бумажная хроматография

Бумажная хроматография подходит для первого знакомства с методом. На полоске фильтровальной бумаги простым карандашом проводят стартовую линию примерно в 1,5 сантиметра от нижнего края. На эту линию наносят маленькую каплю исследуемого раствора и дают ей высохнуть. Затем бумагу ставят в стакан или банку с небольшим количеством растворителя. Уровень жидкости должен быть ниже стартовой линии, иначе проба просто растворится в сосуде.

Сосуд закрывают крышкой или часовым стеклом, чтобы пары растворителя насыщали воздух внутри и бумага не высыхала неравномерно. Растворитель поднимается вверх, его видимую границу называют фронтом растворителя. Когда фронт почти дошёл до верхнего края, бумагу вынимают и сразу отмечают карандашом его положение. После высушивания становятся заметны разделившиеся окрашенные зоны. Бесцветные вещества иногда проявляют специальным реагентом или рассматривают в ультрафиолетовом свете.

Преимущество бумаги в доступности и наглядности. Однако она даёт менее чёткие пятна, чем специальные пластинки, и хуже подходит для сложных анализов. Нельзя делать стартовую каплю крупной: широкая расплывшаяся зона способна перекрыть соседние компоненты. Для сравнения на одну стартовую линию наносят исследуемую смесь и рядом известные образцы. Если после опыта пятна располагаются на одинаковой высоте в одинаковых условиях, это аргумент в пользу присутствия соответствующего вещества, но не окончательное доказательство.

Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография, сокращённо ТСХ, устроена похожим образом, но вместо бумаги используют пластинку с ровным слоем сорбента. Чаще всего это силикагель. Пластинку помещают в герметичную камеру с растворителем, нанося пробу на линию старта капилляром. Растворитель движется вверх, а компоненты дают отдельные пятна. После сушки пластинку осматривают: некоторые вещества видны сразу, другие проявляют йодом, нингидрином или ультрафиолетовой лампой в зависимости от задачи.

ТСХ удобна для контроля химической реакции. Например, в лаборатории берут каплю реакционной смеси через несколько минут и наносят на пластинку рядом с исходным веществом. Если пятно исходного вещества исчезло, а появилось новое, можно судить о ходе превращения. Метод также помогает проверить чистоту вещества: одно пятно при выбранных условиях говорит о большей чистоте, несколько пятен указывают на примеси или смесь. Но одно пятно не гарантирует абсолютную чистоту, поскольку разные вещества иногда имеют одинаковую подвижность.

Коэффициент Rf

Чтобы описать результат не словами «пятно высоко» или «пятно низко», используют коэффициент удерживания Rf. Его находят как отношение расстояния от стартовой линии до центра пятна к расстоянию от старта до фронта растворителя. Обе величины измеряют вдоль направления движения подвижной фазы. Формула выглядит так: Rf = l_пятна / l_фронта.

Допустим, фронт растворителя прошёл 8,0 см, а центр синего пятна находится на расстоянии 4,8 см от старта. Тогда Rf = 4,8 / 8,0 = 0,60. Значение не имеет единицы измерения и лежит от 0 до 1. Если пятно осталось на старте, Rf близок к нулю. Если оно переместилось почти вместе с фронтом, значение близко к единице.

Сравнивать Rf можно только при одинаковых условиях: на одном сорбенте, с тем же растворителем, в сходной камере и при той же методике. Нельзя взять число из чужого опыта и по нему без проверки назвать вещество. В школьной работе коэффициент полезен для сопоставления пятен смеси с пятнами образцов. В серьёзном анализе его дополняют другими данными, например спектром вещества.

Где используют метод

Хроматографические методы применяют в медицине, экологии, пищевой промышленности, криминалистике и фармацевтике. Врачебные и научные лаборатории исследуют состав биологических жидкостей, определяют лекарства и их продукты превращения. Экологи ищут следы загрязнителей в воде, почве и воздухе. Производители контролируют красители, ароматизаторы и примеси в сырье. В криминалистике сравнивают чернила документов, волокна, красители и следовые количества веществ.

Для летучих соединений часто используют газовую хроматографию. Поток инертного газа переносит испарённую пробу через колонку, а прибор регистрирует время выхода компонентов. Для растворённых и нелетучих веществ подходит высокоэффективная жидкостная хроматография. В этих методах результат выглядит не как цветные пятна, а как хроматограмма с пиками. Положение пика и его площадь помогают установить компонент и оценить его количество.

Пошаговый школьный опыт и ошибки

Безопасный вариант опыта можно выполнить с водорастворимыми фломастерами, фильтровальной бумагой, водой, стаканом и карандашом. Не используйте спиртовые маркеры, если растворителем служит вода: краситель может не раствориться. Не проводите опыт с неизвестными бытовыми растворителями, бензином или концентрированными реактивами без преподавателя и лабораторного оснащения.

1. Вырежьте полоску фильтровальной бумаги шириной 2-3 см и длиной около 12 см.
2. Проведите карандашом стартовую линию в 1,5 см от нижнего края. Чернила ручки использовать нельзя: они сами разделятся и испортят результат.
3. Поставьте на линию маленькую точку фломастером. Для сравнения можно нанести рядом точки разных цветов с промежутком не менее 1 см.
4. Налейте в стакан воду слоем несколько миллиметров и закрепите полоску так, чтобы нижний край касался воды, а точки оставались выше её уровня.
5. Накройте стакан, дождитесь подъёма воды почти до верхнего края бумаги, выньте полоску и сразу отметьте карандашом фронт.
6. Высушите хроматограмму, измерьте расстояния до центров цветных зон и при желании вычислите Rf.

Самые частые ошибки связаны с уровнем растворителя и подготовкой бумаги. Если стартовая линия оказалась в воде, образец смоется со старта вместо разделения. Если касаться рабочей поверхности пальцами, жир и влага оставят следы, изменяющие движение жидкости. Наклонённая пластинка или бумага даёт кривой фронт, поэтому измерять расстояния становится трудно. Слишком много образца приводит к хвостам и слившимся пятнам.

Ещё одна ошибка состоит в том, что фронт растворителя не отмечают сразу после извлечения бумаги. Пока лист высыхает, граница исчезает, а без неё нельзя найти Rf. В ТСХ также важно не опускать сорбент в растворитель выше линии старта и не двигать камеру во время опыта. Аккуратно выполненная хроматограмма позволяет увидеть состав смеси гораздо яснее, чем исходная капля красителя.